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本生一秒帶您看懂——酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是的標(biāo)記免疫分析技術(shù)之一。
它基于一種酶標(biāo)記抗體，能夠檢測(cè)固定在96孔或384孔酶標(biāo)板上的抗原，加入的底物可以產(chǎn)生與原始樣品中存在的抗原量相關(guān)的顏色變化或光信號(hào)。這是一種簡(jiǎn)單而快速的技術(shù)，用于檢測(cè)附著在固體表面的抗體或抗原。作為最敏感的免疫分析方法之一，ELISA在實(shí)驗(yàn)室研究、疾病生物標(biāo)志物診斷和各個(gè)行業(yè)的質(zhì)量控制方面具有商業(yè)價(jià)值。
ELISA的主要類型
根據(jù)抗原固定策略、抗體標(biāo)記策略以及抗體-抗原反應(yīng)類型(直接識(shí)別或競(jìng)爭(zhēng))的不同，ELISA可以分為：
直接法、間接法、夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法。
直接法ELISA
直接法ELISA是的ELISA形式。抗原通過(guò)一段時(shí)間的孵化被動(dòng)地附著在酶標(biāo)板孔底部。在簡(jiǎn)單的洗滌步驟后，通過(guò)添加與酶共價(jià)連接的抗體來(lái)檢測(cè)抗原。孵化和洗滌后，通過(guò)添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時(shí)間后，或在規(guī)定時(shí)間通過(guò)化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計(jì)中讀取顯色。
由于只涉及一個(gè)抗體，所以直接法ELISA適用于樣品中抗原的定性或定量檢測(cè)、抗體篩選和表位基因圖譜。這種方法沒有交叉反應(yīng)的二抗，可以在更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。然而，一抗的免疫反應(yīng)可能會(huì)受到酶標(biāo)記的不利影響。標(biāo)記的一抗不常用，因此使用直接法ELISA時(shí)，需要為每個(gè)特定的ELISA系統(tǒng)標(biāo)記一抗。
間接法ELISA
間接法ELISA檢測(cè)是在直接法ELISA的基礎(chǔ)上添加一個(gè)標(biāo)記二抗進(jìn)行檢測(cè)，是目前的ELISA形式。抗原通過(guò)孵化被動(dòng)地附著在孔上。洗滌后，抗原與抗原特異性抗體一起孵化。洗滌后，添加與酶共價(jià)連接的抗體，此抗體對(duì)第一次添加的抗體所產(chǎn)生的物種具有特異性，可以檢測(cè)所有結(jié)合的抗體。孵化和洗滌后，可以進(jìn)行測(cè)試和讀數(shù)。
與直接法ELISA類似，間接法ELISA可用于抗體篩選、表位基因圖譜和蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。二抗的作用是增強(qiáng)一抗的信號(hào)，使間接ELISA比直接ELISA更敏感。然而，它也會(huì)產(chǎn)生更高的背景信號(hào)，并可能降低整體信號(hào)。
夾心法ELISA
夾心法ELISA是最有用的免疫測(cè)定形式之一，它設(shè)計(jì)用于檢測(cè)可溶性抗原。根據(jù)使用的抗體數(shù)量，該ELISA有兩種形式。兩者的原理是相同的，一種是直接將抗原固定在固相上，另一種是將捕獲抗體固定在固相上以捕獲抗原。
? 直接夾心法ELISA(圖3a)中，捕獲抗體被附著在固相上。洗去多余的未結(jié)合抗體后，加入的抗原被特異性捕獲。然后用第二種酶標(biāo)記的抗體直接針對(duì)該抗原進(jìn)行檢測(cè)。這種類型的檢測(cè)適用于有單一物種抗血清可用，且抗原不能很好地附著在板上時(shí)。
? 間接夾心法ELISA(圖3b)中，通過(guò)第二種未標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)抗原。該抗體則使用酶標(biāo)記的偶聯(lián)物來(lái)檢測(cè)。重要的是偶聯(lián)物不能與捕獲抗體結(jié)合，因此產(chǎn)生捕獲抗體的物質(zhì)必須是不同的。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，可以使用單一的抗偶聯(lián)物來(lái)檢測(cè)任意數(shù)量樣品中抗體的結(jié)合。
這種方法適用于抗原被其他蛋白質(zhì)污染或低濃度時(shí)。在這些情況下，抗原不能以足夠高的濃度直接附著在固相上，以使用直接或間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)。夾心ELISA依賴于具有至少兩個(gè)抗原位點(diǎn)的抗原，以便至少兩個(gè)抗體群可以與之結(jié)合。
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA
直接法ELISA是的ELISA形式。抗原通過(guò)一段時(shí)間的孵化被動(dòng)地附著在酶標(biāo)板孔底部。在簡(jiǎn)單的洗滌步驟后，通過(guò)添加與酶共價(jià)連接的抗體來(lái)檢測(cè)抗原。孵化和洗滌后，通過(guò)添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時(shí)間后，或在規(guī)定時(shí)間通過(guò)化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計(jì)中讀取顯色。
上述系統(tǒng)是ELISA的基本配置。所有這些都可以適用于使用競(jìng)爭(zhēng)或抑制條件測(cè)量抗原或抗體，如圖4所述。隨著溶液中游離抗原(抗體)量的增加，將與固定基質(zhì)結(jié)合的抗體(抗原)量會(huì)減少。在洗滌步驟之后，添加發(fā)色團(tuán)底物以產(chǎn)生信號(hào)(顏色變化或光)。抗體/抗原挑戰(zhàn)引起的信號(hào)變化揭示了競(jìng)爭(zhēng)性抗原/抗體的信息。樣品中的抗原越多，最終孔底結(jié)合的參照抗原的抗體就越少，信號(hào)就越弱。
將可能含有抗原的未知樣品與含有已知量純化抗原的類似樣品進(jìn)行比較時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)法ELISA適用于測(cè)量復(fù)雜混合物中的抗原濃度。
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